这一时期，包括本世纪40年代至60年代。在此期间，病毒学不论是在理论上还是在实践上都有很大的发展，逐步形成了一门独立的学科。由于这个时期对病毒的化学本质有了更清晰的认识，因而也有了较为统一的、明确的病毒概念。

　　1、利用大肠杆菌研究噬菌体的感染过程取得了迅速发展。以M.Delbruck和A.D.Hershey等领导的“噬菌体小组”围绕噬菌体与感染细菌细胞的相互关系进行了大量而深入的研究。这一时期的突出贡献在于：1940年M.Delbruck阐明了噬菌体的复制周期；1950年A.Lwoff揭示了溶原性噬菌体诱导的原理；1952年A.D.Hershey证明了噬菌体DNA的感染性；1952年N.D.Zinder发现了噬菌体的转导现象；1952年E.Wollman发现了溶原性噬菌体。

　　2、组织培养技术开始应用于动物病毒的研究。我国学者黄祯祥早在1943年就利用鸡胚组织块在试管内进行病毒传代、定量滴定及中和试验。我国已故微生物学和病毒学的奠基人高尚荫院士，1958年在国际病毒学研讨会上宣读了《培养脓细胞的组织培养方法研究》论文，从此揭开了中国昆虫病毒学研究的新篇章。许多学者采用这一新技术，相继分离了上百种过去对动物不敏感的新病毒，如腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、Echo病毒和柯萨奇病毒，大大拓宽了病毒学的研究范围。组织培养技术不仅发展了临床病毒学，而且还可用于研究病毒的复制和遗传，使人们对病毒本质有了进一步的认识。

　　1949年J.J.Enders利用单层细胞培养繁殖脊髓灰质炎病毒取得成功，并且由于他对脊髓灰质炎病毒的开创性研究，而于1954年获得诺贝尔奖。1952年Dulbecco利用细胞单层培养进行了蚀斑试验，1953年Salk用细胞培养的脊髓灰质炎病毒制备出灭活疫苗，1957年Stewart用细胞培养技术还分离出多瘤病毒。目前组织培养技术已广泛应用于未知传染因子的分离，病毒病诊断，疫苗生产，以及病毒感染和复制的基础研究。

　　组织培养技术对动物病毒研究所作的贡献主要包括：病毒转录新途径和翻译新途径的发现；病毒对宿主范围的选择；某些肿瘤病毒引起的细胞转化；某些病毒侵染引起的细胞融合；发现有的病毒核酸由若干片段组成；有的病毒核酸具有极性的不同，如小RNA病毒为正链RNA病毒，正粘病毒为负链RNA病毒。

　　3、植物病毒不断有重要的发现，如1952年J.I.Harris揭示了TMV外壳蛋白的化学性质，1955年H.Fraenkel-Conrat成功地将TMV的核酸及其蛋白亚基重建出感染的TMV，1956年H.Fraenkel-Conrat还证明TMV-RNA分子具有感染性，1956年F.A.Anderer阐明了TMV外壳蛋白变性的可逆性；1960年A.Tsugita测定了TMV外壳蛋白的氨基酸序列。中国农业大学裘维蕃院士对北京大白菜三大病害和华北小麦丛矮病等进行了深入研究。